近年来，越来越多的证据表明拥有3D多孔结构的组织工程材料与生物体细胞外基质更加接近，这不仅可以为细胞的粘附和生长提供一定的力学支撑，而且可以有效地调节细胞的生理活动^[1-3]。拥有3D纳米网状结构的葡萄糖线性超分子聚合物，细菌纤维素(BC)以其优越的力学性能，生物相容性及适应性而成为组织工程学近年来研究的热点^[4-6]。由于BC拥有与其他纤维素相似的化学结构，在人体内环境中无法发生降解，很大程度上限制了BC在组织工程材料中的应用。Li等^[7]通过利用高碘酸对BC进行氧化，制得的双醛细菌纤维素具有很好的可生物降解性能，为制备具有优良力学性能，生物相容和生物可降解性的BC基组织工程材料提供了良好的途径。

明胶作为胶原蛋白部分变性产物，具有低抗原性和可生物降解性，含有着大量的重复氨基酸序列单元RGD (Arg-Gly-Asp)，有利于细胞外基质蛋白及整合素的吸附，起到很好调节细胞的粘附，增殖及生理代谢作用^[8-10]。同时，明胶分子中大量的活性基团为制备明胶复合材料提供了更多的化学位点。考虑到这些因素，实验利用高碘酸对BC氧化制得双醛细菌纤维素，然后与明胶溶剂进行交联，旨在制备具有优良性能的3D生物质组织工程材料。

H₂SO₄(98%, AR)，乙二醇(99.5%, AR)，盐酸羟胺(98.5%, AR)，明胶(BR)，成都科龙化工试剂厂；高碘酸钠(99.5%, AR)，Na₂SO₄ (99.5%, AR)，天津科密欧化学试剂厂；细菌纤维BC (BR)，海南亿德食品有限公司。

FTIR型红外光谱仪(美国)；Tristar 3000型比表面与孔隙度分析仪(英国)；JSM-7500F型扫描电镜(日本)；TG209F1型热重分析仪(德国)；AI-7000SN型万能材料测试仪(台湾)。

称取一定质量的BC膜置入锥形瓶，在摇床上浸入100倍(按BC质量计)蒸馏水中，用NaOH调节至中性，并用100倍去离子水水洗2次，各5 min。在锥形瓶中加入100倍去离子水，1.0 mol/L硫酸调节pH 1.0，加入1.3倍高碘酸钠，遮光条件下，40 ℃恒温振荡反应4 h。反应结束后，用100倍乙二醇洗涤除去未反应的高碘酸盐，并用100倍去离子水水洗3~5次，各5 min。冷冻干燥获得双醛细菌纤维素(DHBC)。定量称取DHBC，根据席夫碱反应原理，利用盐酸羟胺法测定醛基质量分数^[11]。

称取相同质量3份DHBC，分别加入明胶溶液中使m(DHBC):m(明胶)分别为为1:5，1:10和1:15。用1.0 mol/L硫酸调节pH6.0，控温50 ℃，恒温振荡反应4 h。反应结束后，用100倍30 ℃去离子水水洗2次，各5 min，除去表面粘附的明胶，冷冻干燥，获得复合产物分别标记为DB-G5、DB-G10、DB-G15。反应过程见图 1。

图1(Fig. 1)

图1 DHBC与明胶缩合反应路线图 Fig. 1 Condensation reaction route of DHBC and gelatin

BC、DHBC和DB-G膜(15 mm × 15 mm)各取7组，精确称重，记为M₀₁~M₀₇，浸没于模拟体液^[12](SBF)中，恒温培养箱调温至37 ℃，分别放置1、7、14、21、30、60和90 d。结束后用去离子水洗涤，冷冻干燥，称重，记为M_d1~M_d7。分别计算失重率M_L为：

通过红外光谱仪(FTIR)分析对比材料结构的变化情况，扫描波长范围4 000~500 cm^-1，分辨率8 cm^-1，扫描次数32。利用比表面与孔隙度分析仪测定材料的比表面积与孔隙度的变化情况，吸附气为氮气。通过扫描电镜(SEM)观察材料的3D结构形貌的变化情况，扫描电压5 kV。并经过热重分析仪测定不同阶段材料热稳定性的变化情况，扫描温度范围40~600 ℃，升温速率10 ℃ /min。通过万能材料测试仪对材料的抗张强度进行测试，测试样品含湿65%，拉伸速度50 mm/min。

可降解型组织工程支架材料要求有适当的降解周期，一方面, 确保在组织尚未形成或尚不足以承担力学负荷时起到主要的支撑作用，有利于细胞的扩增，组织的形成；另一方面, 在组织形成后，支架材料的完全降解以实现最终的修复与替代^[13-14]。BC、DHBC及DB-G样品在SBF中的降解性能测试结果如图 2所示。如预期BC表现出来了在SBF环境下几乎不降解的特性。而通过HIO₄对BC的氧化，DHBC以及DB-G支架材料都表现出了良好的可降解性。在60~90 d后，基本实现了材料的完全降解。90 d后DHBC的失重率达到了(86.6±2.5)%，DB-G5、DB-G10、DB-G15的失重率分别为(90.1±2.1)%、(92.8±1.9)%、(95.1±2.0)%，满足一般组织工程支架材料的降解周期要求。经实践证明，在组织修复过程中，70~105 d内，组织支架材料将会退化，新的组织将会形成，修复得以完成^[15]。因此，DB-G是一种由生物质构成潜在的可降解组织工程支架材料。

图2(Fig. 2)

图2 不同降解阶段ML变化情况 Fig. 2 Changes of ML of samples in different degradation time

图 3为BC、DHBC、DB-G5、DB-G10、DB-G15红外谱图对比结果。通过羟胺法测得DHBC中羰基质量分数为(42.6±0.5)%。与BC (曲线a)相比，DHBC的红外谱图中在1 740 cm^-1(见箭头标注)处出现了明显的v(C＝O)特征峰。3 200~3 500 cm^-1处宽的缔合吸收峰为分子结构中v(—OH)特征吸收峰，1 000~1 150 cm^-1处为v(C—O)吸收峰^[16-17]。与DHBC相比，DB-G的红外谱图中v(C＝O)吸收峰消失了，但出现了一组新的特征峰(见方框标注)，可以观察到典型的酰胺Ⅰ v(C＝O)在1 600~1 680 cm^-1的特征吸收峰(v(CN)也在这个波数区域), 以及酰胺Ⅱ v(N—H)在1 500~1 550 cm^-1的特征吸收峰^[17-18]，这说明DHBC中的活性基团—CHO与明胶中的—NH₂出现交联键合(反应式见图 1)。另外，可以同时观察到随着交联明胶量的增多，DB-G中酰胺Ⅰ及酰胺Ⅱ特征吸收峰强度变弱，峰变宽，并且吸收峰向高波数发生部分偏移(见图 3中对比数据)，这可能是由于随着交联结合明胶量的增加，分子内与分子间氢键缔合作用的影响不断增大^[17]。

图3(Fig. 3)

图3 不同材料的红外光谱图 Fig. 3 FT-IR spectra of different materials

组织工程支架材料要求具有3维多孔结构，高的孔隙率和比表面积以满足代谢产物和气体的交换通道、细胞再生的空间^[19-21]。实验样品的比表面积变化情况如图 4所示。

图4(Fig. 4)

图4 不同材料的BET比表面积变化情况 Fig. 4 Changes of BET surface area of different materials

DB-G5、DB-G10、DB-G15的比表面积(65.20±0.56)、(53.13±0.43)、(39.24±0.76) m²/g呈下降趋势，这就说明随着交联明胶量的增多，材料内部的孔径相对减小或孔隙率降低(从SEM图中可以得到进一步证实)。同时，致密性过高对细胞前期在支架材料上的黏附、迁移是不利的。从材料的孔径变化可以观察到，相对BC、DHBC由于氧化剂对分子链的侵蚀破坏，使得DHBC孔径变大明显。DB-G5、DB-G10、DB-G15的孔径变化呈现出了不断减小的趋势，这与比表面积的测定结果相对应(见图 5)。这是由于随着交联明胶量的增加，在DHBC分子链被大量的明胶分子结合包裹着或其孔隙被填充，使得材料的孔径不断减小，如图 6所示。尤其DB-G15比表面积及孔径迅速减小甚至被封闭，这将不利于组织细胞的黏附和迁移。

图5(Fig. 5)

图5 不同材料的孔径分布 Fig. 5 Porosity distribution of different materials

图6(Fig. 6)

图6 不同复合材料的SEM图像 Fig. 6 SEM images of different materials

综合比表面积与孔径分布特征及SEM测试结果分析，样品DB-G10既保证了明胶用量比例，同时保留了必要的多孔结构。

材料的热分解稳定性能测试见图 7。

图7(Fig. 7)

图7 不同材料的TG和DTG测试结果 Fig. 7 TG and DTG test results of materials

从初始失重温度(T_i)数据可知，与BC相比, DHBC由于氧化剂的氧化侵蚀，分子间与分子内结构遭到破坏，稳定性下降。BC的初始失重温度T_(BC)由252.5 ℃降低到了T(DHBC)的187.3 ℃。而DB-G5、DB-G10、DB-G15则由于DHBC与明胶的键合交联，使材料的热分解稳定性显著提高，T(DB-G)(324.3、326.7、328.4 ℃)高于T(明胶)(293.6 ℃)与T(DHBC)。根据不同材料DTG曲线的峰值，可以看到DHBC的最大失重温度T_max(DHBC)为231.9 ℃，与Tmax (BC)(312.0 ℃)相比下降了80.1 ℃。而一旦与明胶发生交联，热分解稳定性得到明显提高，DB-G5、DB-G10、DB-G15的Tmax (DB-G)分别为348.1、365.3、367.1 ℃，表明DHBC与明胶的交联提高了热分解稳定性。同时，可以观察到DB-G10和DB-G15的最大失重温度不足2 ℃。假设热分解温度与交联相关，这就说明m(DHBC):m(明胶)=10时接近了理想的交联，继续增加明胶比例对热分解稳定性影响较小，而对比表面积与孔隙度产生不利影响。

根据图 8中测试结果，可以看到由于HIO₄的氧化处理，使得细菌纤维素分子结构的破坏，DHBC的抗张强度出现明显的下降，但是，随着与明胶比例增加，复合物样品的抗张强度得到提高，其中, DB-G5和DB-G10抗张强度分别达到0.31、0.35 MPa，作为潜在的支架材料，提供了良好的力学承载力及结构稳定性。但与DB-G10相比，DB-G15(0.35 MPa)并没有随着明胶用量的进一步提高，这也与TG/DTG的分析结果巧合，DB-G15并没有明显提高热解稳定性。

图8(Fig. 8)

图8 不同材料的抗张强度测试结果 Fig. 8 Tensile strength test results of different materials

降解性能的测试结果表明，DB-G有着较好的可生物降解的性能，SBF中90 d失重率均在90%以上，可以满足组织工程材料要求的降解周期。根据比表面积与SEM的测试结果证明，DB-G10维持了适当的比表面积和孔径，保证了细胞的黏附、扩散、增殖以及代谢产物的必要特征。DB-G的初始失重温度都高于320 ℃，表现出良好的热解稳定性，表达了样品结构稳定性。同时，良好的力学性能也将确保在新组织形成之前，提供良好的力学承载力及结构稳定性。综合分析表明，m(DHBC):m(明胶)为1:10时，即可达到理想的要求。DB-GEL10可作为一种潜在的生物质组织工程材料。